Em 1997 recebeu o convite para trabalhar em Days of Our Lives, como Eric Brady, ganhando o prêmio de ator revelação no Opera Digest Award, em 1998. Após ter deixado a série em 2000, Ackles foi atuar em Dark Angel, tendo sua primeira aparição em 2001 como o irmão perturbado Ben/X5-493.Depois que Ben morreu, Ackles, retornou à série, na segunda temporada, como o clone de Ben, que permaneceu até o fim de 2002.

Em 2003 fez diversas aparições na série Dawson's Creek, da WB. Em 2004 participou ativamente da série Smallville, interpretando o personagem Jason Teague, assistente do treinador de football e também namorado de Lana Lang (Kristin Kreuk). Após uns meses ausente, Ackles retornou à televisão em 2005 para atuar em Supernatural, nova série de suspense da WB, no papel do politicamente incorreto Dean Winchester ao lado de seu irmão Sam Winchester Jared Padalecki, viajando pelo país a procura de seu pai e buscando respostas sobre a morte sobrenatural de sua mãe. O negócio da família é eliminar demônios, fantasmas e outras criaturas das trevas.